1、什么是iTRAQ？
iTRAQ技術(shù)，即同位素相對標(biāo)記與絕對定量技術(shù)。該技術(shù)可對復(fù)雜樣本、細(xì)胞器、細(xì)胞裂解液等樣本進(jìn)行相對和絕對定量研究，具有較好的定量效果、較高的重復(fù)性。由于其能夠同時對多達(dá)8種樣品進(jìn)行標(biāo)記分析，故在生命科學(xué)的各個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。
2、iTRAQ的原理是什么？
iTRAQ的檢測可以做這樣的比喻，蛋白被打成肽段后，被平均的鋪在了一個有384個孔的平板上，然后機(jī)器會從每個孔中選取濃度在前5名的蛋白進(jìn)行鑒定和比對，所以，如果假設(shè)每個一個樣本中有100個蛋白，他們的濃度均為1%，那么得到的結(jié)果就是蛋白的得分低，但是鑒定的蛋白數(shù)量會很多，可以達(dá)到90以上；如果一個樣本中有100個蛋白，有3個蛋白的含量分別為30、20、10、其他的97鐘蛋白為剩下的50%，那么這三種蛋白的得分高，但是鑒定出的蛋白數(shù)量會比較少，也許只有50或者60個。因?yàn)橐恍└哓S度的蛋白會大量分部在上述的小孔中，抑制了其他蛋白的檢出效果。
3、iTRAQ的主要優(yōu)勢有哪些？
(1) 高通量
一次性定性和定量該樣本的總蛋白，不用像雙向電泳(2DE)或DIGE要逐個斑點(diǎn)做鑒定；2DE可分離1500-2500個斑點(diǎn)(并且可能很多斑點(diǎn)對應(yīng)同一種蛋白)，而iTRAQ一般可鑒定2000種以上蛋白，其中常規(guī)動物組織或細(xì)胞可鑒定到4000-7000種蛋白；
(2) 結(jié)果直觀、分析靈活
直接得到蛋白的定性和相對定量信息，可利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法快速篩選出各個組別的差異蛋白；能更好的結(jié)合基因組或轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，十分有利于后續(xù)研究。
(3) 對樣本類型無限制
任何類型的樣本均可做，當(dāng)然數(shù)據(jù)庫越全、鑒定到的蛋白種類越多；對于罕見物種，可提供轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來檢索，更容易找到有意義的蛋白。
(4) 加了數(shù)據(jù)的可靠性和相關(guān)性
一次上機(jī)的樣本數(shù)高達(dá)8個，如果樣本數(shù)多于8個，還可以在每次上機(jī)時設(shè)置內(nèi)參，每個樣本先跟內(nèi)參比較，再相互比較(排除操作、環(huán)境和儀器誤差)，從而實(shí)現(xiàn)多組樣本間的差異蛋白分析。
4、iTRAQ與其他蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的區(qū)別是什么？
雙向電泳是最早、最經(jīng)典的蛋白質(zhì)組技術(shù)，適用于大部分樣本，只是對強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性蛋白，以及分子量太大或太小的蛋白質(zhì)分離效果不好；另外由于各個樣本需要單獨(dú)跑膠，很難避免操作誤差對結(jié)果的影響，可能導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確；但是雙向電泳的服務(wù)價格相對便宜，可以用于樣本差異的初步篩選；
DIGE在雙向電泳基礎(chǔ)上做了改進(jìn)，引入了熒光標(biāo)記物和內(nèi)標(biāo)，可以使定量更加準(zhǔn)確；但該技術(shù)也是依據(jù)蛋白的等電點(diǎn)和分子量分離，因此對強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性蛋白，以及分子量太大或太小的蛋白質(zhì)分離效果也不好。
iTRAQ、TMT、label-free和SILAC都是利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)來尋找差異蛋白。其中，iTRAQ和TMT的原理和檢測方法基本一致，只是使用了不同的標(biāo)記物；TMT有10種標(biāo)記物，可對多達(dá)10種不同樣本進(jìn)行分析，但是由于其標(biāo)記物的質(zhì)量數(shù)非常相近，因此必須使用超高分辨率的質(zhì)譜才可以滿足檢測，這也必然會導(dǎo)致信號干擾更多，可能會影響定量的準(zhǔn)確性；label-free是非標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，由于沒有標(biāo)記物，其定量需要依賴于操作和質(zhì)譜儀的穩(wěn)定性，該技術(shù)鑒定到的蛋白數(shù)目會少于iTRAQ技術(shù)，并且定量的準(zhǔn)確性較差，優(yōu)勢是服務(wù)費(fèi)用較低；SILAC是基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，利用不同的同位素培養(yǎng)基來培養(yǎng)不同組別的細(xì)胞，達(dá)到體內(nèi)標(biāo)記的目的，其定量準(zhǔn)確性要比其他蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)更高；但是由于缺乏合適的同位素培養(yǎng)基，該方法基本只能用于可傳代的哺乳動物細(xì)胞系。
從定量準(zhǔn)確性、應(yīng)用性等各方面綜合考慮， iTRAQ技術(shù)已成為近年來利用最廣泛的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。
5、iTRAQ實(shí)驗(yàn)對樣本有何要求?
任何類型的樣本都可以，如果是罕見物種，可以用近緣物種的數(shù)據(jù)庫檢索，也可提供轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫來檢索；一次上機(jī)，每組樣本需要用200μg蛋白，但由于需要蛋白定量檢測和預(yù)實(shí)驗(yàn)，因此每組樣本所需的蛋白量大概在500μg左右；我公司負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的提取，客戶只需要提供足夠的原始樣本。
6、不同類型的樣本做iTRAQ能否一次上機(jī)？
不能。如果樣品來源于不同物種，檢索時就無法選擇數(shù)據(jù)庫，也就無法分析數(shù)據(jù)；即使是同一物種的樣本，它們的蛋白種類和豐度也可能有很大差別(比如植物的根和葉)，將這些酶切肽段混合上機(jī)，其數(shù)據(jù)會相互干擾，導(dǎo)致蛋白定性和定量的不準(zhǔn)確。
7、iTRAQ實(shí)驗(yàn)是否需要設(shè)置重復(fù)？
通常重復(fù)包括生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)，iTRAQ中常說到的還有上機(jī)重復(fù)；生物學(xué)重復(fù)即樣本重復(fù)，采集來源于同一組別的不同樣本(例如同樣處理的不同植物、同一疾病的不同患者血清等)，通常設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，但臨床樣本一般要求生物學(xué)重復(fù)更多(如疾病組和健康組各十幾例樣本)；當(dāng)生物學(xué)重復(fù)的樣本很多時，可以將同組樣本混合后再標(biāo)記，便可以通過一次上機(jī)檢測；技術(shù)重復(fù)，通常是同一個樣本用不同標(biāo)記物標(biāo)記，這樣可以排除因蛋白提取、酶解、標(biāo)記等操作引入的誤差；另外iTRAQ實(shí)驗(yàn)有時會設(shè)計(jì)上機(jī)重復(fù)，這其實(shí)也屬于技術(shù)重復(fù)的范疇，即相同的樣本上兩次機(jī)，來排除操作誤差和儀器誤差。目前發(fā)SCI論文一般需要設(shè)置重復(fù)(無論何種重復(fù))，否則可能會被質(zhì)疑數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性；另外從數(shù)據(jù)質(zhì)量上講，重復(fù)能更有效的幫助我們排除不可信蛋白，無論是對WB驗(yàn)證還是后續(xù)研究，都是很有利的。
8、iTRAQ的重復(fù)性好不好？
iTRAQ重復(fù)性通常是指定量的重復(fù)性，即同樣的樣本在上機(jī)兩次時得到的結(jié)果是否一致；iTRAQ實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的好壞就決定了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。一般來說，由于質(zhì)譜選取肽段的隨機(jī)性，可能導(dǎo)致檢測到的肽段及其強(qiáng)度不同，在經(jīng)過軟件匹配分析后，得到的蛋白比值可能會不一樣。一般得分和比值比較靠后的蛋白才會出現(xiàn)定量的嚴(yán)重偏差，而絕大部分蛋白的比值趨勢是一致的。因此在分析時，我們會將鑒定到的蛋白先按FDR(錯誤發(fā)現(xiàn)率)或unused值進(jìn)行篩選，選取置信度大于95%(unused＞1.3)或99%(unused＞2)的蛋白作為可信蛋白，再進(jìn)行分析。
9、按什么標(biāo)準(zhǔn)來選取差異蛋白？
差異蛋白的選取目前并沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，有多種選擇方法，根據(jù)比值篩選，結(jié)合比值和標(biāo)準(zhǔn)差篩選，或根據(jù)T-Test篩選；我們目前一般根據(jù)比值進(jìn)行選擇，即差異倍數(shù)≤0.67和≥1.5，有時也會按照p≤0.05的標(biāo)準(zhǔn)過濾。
10、iTRAQ實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用不同數(shù)據(jù)庫檢索時，各組間的比值為何是不同的？
iTRAQ技術(shù)中不同標(biāo)記物之間的比值與檢索數(shù)據(jù)庫、質(zhì)譜電信號的噪音以及采集質(zhì)譜時的隨機(jī)性都有關(guān)。所以在使用不同數(shù)據(jù)庫檢索時，由于匹配肽段情況的不同，定量結(jié)果也有些許差異，但是總體變化趨勢應(yīng)是一致的。
11、檢索時為什么同一個編號對應(yīng)了很多蛋白質(zhì)？
因?yàn)橐粋�蛋白家族中常常含有多個同源性很高的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)被酶切之后，很可能會產(chǎn)生很多相同的肽段，軟件在進(jìn)行定性分析時，就會將這些肽段均歸于得分最高的那種蛋白質(zhì)，其他同源蛋白不計(jì)分，并且這些同源蛋白都采用同一編號。
12、LC/MS中蛋白處理是定量還是定性？
這是屬于定量，需在蛋白定量后，各取相同量(50-100μg)的蛋白(體積不大于25μl，少于25μl的用專用裂解液補(bǔ)至25μl)進(jìn)行還原化和烷基化。
13、LC/MS對需要檢測的蛋白有量的要求嗎？
有。要求蛋白量最低50μg，濃度最低要為5μg/μL，否則同位素?zé)o法標(biāo)記。
14、數(shù)據(jù)分析中主要看哪些參數(shù)？
對于液質(zhì)聯(lián)用的數(shù)據(jù)分析，一般觀察的參數(shù)為：Total Ion Score C.I. %(可信度)和Tag-80/Tag-0(兩樣本的比值)。
15、眾多可信度數(shù)值中，主要選擇哪些進(jìn)行研究？
一般來說可信度在80%以上的均為可信程度非常高的。有些蛋白可信度在60%以上的也可以作為參考數(shù)據(jù)。
16、可信程度低于80%的數(shù)據(jù)有意義嗎？
可信程度低于此值的，如果有感興趣的蛋白可以通過ELISA、WB、Q-PCR、液態(tài)芯片等技術(shù)手段進(jìn)一步驗(yàn)證，畢竟LC/MS是研究蛋白組學(xué)的方法之一，如全面研究還是要綜合各種研究方法。
17、兩樣本的比值都代表什么？
兩樣本的比值如果在0.9-1.1之間的，可以認(rèn)為兩樣本的含量是一樣的，即比值為1:1；而小于0.9或大于1.1均可認(rèn)為兩樣本之間的比值是有差異的。
18、質(zhì)譜圖中顯示的是各種蛋白嗎？
不是各種蛋白而是蛋白被打碎后的離子圖譜，由于質(zhì)譜法是電場和磁場將運(yùn)動的離子(帶電荷的原子、分子或分子碎片)按它們的質(zhì)荷比分離后進(jìn)行檢測的方法。測出的是離子的準(zhǔn)確質(zhì)量，由此來確定離子的化合物組成。
